Quartz 4

PCR

4 min read

wiki technieken techniques noortje

Wat is PCR

Polymerase chain reaction (abbreviated PCR) is a laboratory technique for rapidly producing (amplifying) millions to billions of copies of a specific segment of DNA, which can then be studied in greater detail. AKA. a technique to amplify specific DNA fragments

Source:

Polymerase chain Reaction (PCR). (n.d.). Genome.gov. https://www.genome.gov/genetics-glossary/Polymerase-Chain-Reaction-PCR

Expertz

In dit proces bestaat uit verschillende fases

  1. Denaturatie (~96°C)
    • Deze fase ontbind de dubbele helix structuur tot 2 losse strengen
    • dit vind plaats bij een temperatuur van ~96°C omdat we geen enzymen hebben zoals in een cel
  2. Annealing (primers) (~55°C)
    • Dit zijn stoffen die binden aan het DNA waar vanaf uitgebouwd kan worden voor een kopie
    • Er zijn 2 soorten Primer met mogelijk beide een andere temperatuur
      1. FWD (forward)
      2. REV (reverse)
    • Annealing temp (Ta) is melting temp (Tm) - 5°C
      • Tm kan je laten berekenen door CLC of handmatig voor elke A/T base 2°C en voor C/G 4C°
      • kies altijd voor de laagste annealing temperatuur
  3. Extension / Elongation. (~72°C)
    • in deze fase word het de primer van de vorige stap verlengt met nucleotide,
    • Dit word gedaan door een speciale hitte bestendige variant van DNA polymerase, Taq Polymerase
      • Dit is enzym is afkomstig van een hitte resistente bacterie te vinden bij vulkanische vents

PCR Amplificatie V.S. Cel Replicatie

  • welk deel van het DNA wordt verdubbeld?
    • Replicatie: het hele DNA molecuul
    • amplificatie: een klein stukje DNA (template)
  • Waar start en stopt de replicatie/amplificatie
    • Replicatie: start op een ori en stopt zodra alles verdubbeld is
    • amplificatie: start bij op een primer en loopt het DNA op is of er een andere primer is gevonden
  • welke soort primer wordt er gebruikt? hoeveel?
    • replicatie:RNA primers
    • Amplificatie: 2 DNA primers
      1. fwd
      2. rev
  • Wat zorgt er voor dat de helix uitrolt
    • replicatie: Helicase
    • Amplificatie: Temperatuur
  • welk enzym is verantwoordelijk voor het toevoegen van die nieuwe nucleotide
PCR AmplificatieDNA Replicatie
Amplificeert een specifiek stukje DNAKopieert een compleet DNA molecuul
Gebruikt 2 DNA primersStart vanaf een ori gebruikt RNA primers
Ontwinden van de DNA helix mbv temperatuurOntwind door helicase en topoisomerase ontspant de helix
Elke cyclus word het stukje DNA gebruikt als template (maar ook de nieuwe, dit zorgt voor een exponentiele groei)Replicatie bubbel met ori
Taq PolymerasePolymerase

Een PCR reactie

  • PCR Buffer
  • DNA primer
    1. fwd
    2. rev
  • Taq polymerase
  • Nucleotides
  • Template DNA Fragment
  • MgCl2
  • MilliQ

PCR Primers

Hoe kies ik de juiste primers?

  1. Aim for the GC content to be between 40 and 60% with the 3’ of a primer ending in G or C to promote binding. This is known as a GC Clamp. The G and C bases have stronger hydrogen bonding and help with the stability of the primer.
    • Be mindful not to have too many repeating G or C bases, as this can cause primer-dimer formation._
  2. A good length for PCR primers is generally around 18-30 bases. Specificity usually is dependent on length and annealing temperature. The shorter the primers are, the more efficiently they will bind or anneal to the target.
  3. Try to make the melting temperature (Tm) of the primers between 65°C and 75°C, and within 5°C of each other. Because the Tm is dependent on the length, it’s important to keep primers on the shorter end. The bases also impact the Tm, G and C result in higher melting temperatures than A and T. If the Tm of your primer is very low, try to find a sequence with more GC content, or extend the length of the primer a little.
  4. Typically, 3 to 4 nucleotides are added 5 ’of the restriction enzyme site in the primer to allow for efficient cutting.
  5. Try to avoid regions of secondary (eiwit structuur?) structure and have a balanced distribution of GC-rich and AT-rich domains.
  6. Try to avoid runs of 4 or more of one base, or dinucleotide repeats (for example, ACCCC or ATATATAT).
  7. Avoid intra-primer homology (more than 3 bases that complement within the primer) or inter-primer homology (forward and reverse primers having complementary sequences). These circumstances can lead to self-dimers or primer-dimers instead of annealing to the desired DNA sequences.
  8. If you are using the primers for cloning, we recommend cartridge purification as a minimum level of purification.
  9. If you are using the primers for mutagenesis, try to have the mismatched bases towards the middle of the primer.
  10. If you are using the primers for a PCR reaction to be used in Invitrogen TOPO cloning, the primers should not have a phosphate modification.

Bronnenlijst

  1. Polymerase chain Reaction (PCR). (n.d.). Genome.gov. https://www.genome.gov/genetics-glossary/Polymerase-Chain-Reaction-PCR
  2. Staff, B. B., & Staff, B. B. (2019, September 25). PCR Primer Design Tips. Behind the Bench. https://www.thermofisher.com/blog/behindthebench/pcr-primer-design-tips/

Graph View