Gelelektroforese
Gelelektroforese is een agoarose gel die gebruikt wordt als zeef om moluculen te scheiden op grootte, het is dus een scheidingstechniek.
Die gel wordt op een elektrisch veld gezet waardoor de geladen moleculen door de gel gaan bewegen.
Je krijgt dus:
-
- pool bevindt zich bovenin de gel
-
- pool bevindt zich onderin de gel
Negatief geladen moleculen bewegen naar de + pool
- Hoe kleiner het molecuul, hoe sneller
- Hoe groter het molecuul, hoe langzamer
Stappen gelelektroforese
- DNA wordt geïsoleerd uit sample
- DNA wordt geamplificeerd m.b.v. PCR
- DNA wordt in de welletjes van de gel gepipeteerd
- Op gel wordt elektrisch veld gezet
- DNA wordt gescheiden op grootte
- DNA bandjes worden gekleurd
Bepalen grootte DNA fragmenten
-
Een DNA ladder wordt toegevoegd om de grootte van de DNA moleculen te kunnen bepalen
-
DNA wordt gekleurd om het te kunnen visualiseren
- Bijv. met SBR Safe + blauw/UV licht
DNA ladder: een reeks van DNA bandjes van groot naar klein. Hiermee kun je gemakkelijker bepalen wat de lengte van sommige moleculen zijn.
Sanger Sequencing
Andere naam is dideoxynucleotide sequencing.
Relatief korte DNA fragmenten worden gesequenced met de dideoxy chain termination methode.
Wat is nodig voor Sanger Sequencing
- DNA template
- Nucleotiden:
- dNTPs dATP, dTTP, dGTP, dCTP
- Gemodificeerde nucleotiden:
- dideoxynucleotiden (ddNTPs) ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP
- Gelabeld met verschillende kleuren fluorescerende labels
- Primer
- DNA polymerase
dNTPs: bouwstenen van DNA, OH-groep op 2’ positie in ribose vervangen door H-groep.
ddNTPs: OH-groepen op zowel 2’ en 3’ positie in ribose vervangen door H-groep. In Sanger sequencing zijn deze ddNTPs gelabeld met een fluorescerend label
Stappen bij Sanger Sequencing
- DNA template wordt gedenatureerd → enkelstrengs DNA
- Enkele primer wordt toegevoegd Primer: ~20 nt lang, complementair aan enkelstrengs DNA
- dNTPs en ddNTPs worden toegevoegd
- DNA polymerase synthetiseert een complementaire DNA streng met de dNTPs
- DNA synthese wordt gestopt wanneer DNA polymerase er een ddNTP inzet
De DNA synthese stopt wanneer er een ddNTP in wordt gezet:
- Omdat ddNTPs de 3’ OH-groep missen
- Daarom: dideoxy chain termination methode
Wanneer de DNA synthese stopt, kan het fluorescenende licht worden gemeten
- Geeft informatie over welke nucleotide er op die plek in het DNA is gezet.
Genstructuur
Gen gesequenced → sequentie annoteren en opslaan in database (bijv. NCBI RefSeq database)
- Voorbeelden van annotatie:
- Positie exonen
- Positie intronen
- Positie coding sequence (CDS)
Van MRNA codeert niet alles naar eiwit, dat noemen we de UTR (untranslated region).
Belangrijk om te weten als we de structuur van een gen willen bepalen aan de hand van NCBI annotatie data:
- Hoeveel exonen
- Hoeveel intronen
- Positie transcriptie start en stop
- Positie translatie start en stop
- Positie CDS
- Positie 5’ en 3’ UTR (untranslated region)
- = deel van gen dat niet vertaald wordt = deel dat niet CDS is